Interkom: Elixír života, pohár žluči

Když Gregor Mendel na jaře roku 1860 zaléval hrách na zahrádce brněnského opatství, netušil, že je na stopě důležitého objevu. Velký význam jeho výzkumu nepřikládala ani vědecká obec. Trvalo více než čtyřicet let, než bylo odborné pojednání „Versuche über Pflanzen-Hybriden“ znovu objeveno a doceněno. Díky tomu dnes každé školou povinné dítě ví, že se dědičnost řídí určitými zákonitostmi.

Zrodila se nová věda a na konci tisíciletí dozrála do podoby, kdy ji začínáme prakticky využívat. Dnes jsou molekulární biologové schopni detekovat první genetické choroby, provádět jednoduché genové manipulace nebo klonovat zvířata. Kromě odborných publikací jsou tyto úspěchy bedlivě sledovány i sdělovacími prostředky. Média nás s vervou zásobují tajemně znějícími slůvky jako je genotypování, sekvenování a polymorfismus. Transgenní zvířata a klonování lidí se staly novými strašáky. Kdo z nás ví, co to všechno znamená! Může se v tom běžný smrtelník vyznat? Někdy se zdá, že zmatení pojmů přispívá k paradoxnímu rozštěpení názorů. Genetiku přijímáme buď jako zázrak vědy, nebo jako nudnou samozřejmost.

V první polovině dvacátého století se vědci shodli na tom, že dědičnost je molekulární povahy. Problém byl jak identifikovat, která molekula slouží jako databáze ke skladování a přenosu genetické informace. V podezření byly proteiny, základní stavební jednotky lidského organismu. Pro ně mluvil fakt, že jsou dostatečně komplikované, aby ve své struktuře pojaly genetický kód. V porovnání s nimi je DNA relativně jednoduchá sloučenina. Skládá se z cukerné části (deoxyribóza), na kterou je navázána buď pyrimidinová nebo purinová báze, Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) či Cytosin (C). Tyto takzvané nukleotidy jsou propojené můstky kyseliny fosforečné do dlouhých vláken a střídají se v zdánlivě náhodných sekvencích GAC GGA ATA... Když v roce 1940 americký vědec Oswald Avery nezvratně dokázal, že geny se skládají z deoxyribonukleové kyseliny (DNA), nezbývalo než přiznat, že tato nudná molekula hraje v genetice prim. Bylo zřejmé, že tajemství dědičnosti je zakódováno do posloupnosti nukleotidů.

Od časů klasických řeckých tragédií se příliš mnoho nezměnilo. I dnes se najdou lidé, kteří věří v osud. Mají k tomu i vědecké zdůvodnění: Naše fyziognomie, chování a inteligence jsou prý vepsány do DNA! Jak lákavé je tento osud přečíst! Roku 1990 americký National Institute of Health (NIH) a Department of Energy (DOE) začaly financovat Projekt lidského genomu. Cílem bylo do roku 2005 zmapovat sekvenci všech tří miliard bazí lidské DNA. Přestože je to nesmírně náročný úkol, zdá se, že bude dokončen před termínem. Navazující identifikace genů, objasnění jejich funkce v organismu a studie mutací ovlivňujích lidské zdraví, se protáhnou na mnoho dalších let.

Sekvenování DNA bylo umožněno několika objevy. V první řadě objevem restrikčních enzymů (r. 1967), biologických nůžek, které dokáží rozstřihnout dvojšroubovici DNA v místě specifické sekvence. Bylo možné naporcovat DNA na definované menší fragmenty a snadněji ji studovat. Druhým zlomem se v roce 1983 stal vynález tzv. Polymerase Chain Reaction (PCR). Jak název napovídá, jde o řetězovou reakci, při které je DNA fragment „xeroxován“ pomocí enzymu zvaného polymeráza. Z jednoho fragmentu vznikají dva, ze dvou čtyři, ze čtyř osm a tak jsou kopírovány se stále větší rychlostí. Tímto procesem je možné namnožit „vystřižený“ úsek DNA s neuvěřitelnou efektivitou. Metoda PCR se nyní využívá téměř v každé biochemické laboratoři a je nezbytnou pomůckou i při sekvenování.

Když roku 1977 Maxam a Gilbert objevili metodu selektivního chemického fragmentování DNA, byl to první způsob, jak číst krátké sekvence DNA kódu. Ve stejném roce Frederick Sanger publikoval biochemickou metodu, která se díky pozdějšímu rozvoji PCR stala nejpopulárnějším způsobem sekvenování DNA. V roce 1986 společnost ABI začala prodávat první automatický sekvenátor, o kterém se zmiňuje Michael Crichton ve svém románu Jurský park, a začalo se sekvenovat ve velkém.

Jak vlastně Sangerovo sekvenování funguje? Prvním krokem všech sekvenovacích metod je připravit z původní DNA molekuly směs fragmentů, které se liší v délce vždy o jediný nukleotid. Například z DNA o délce 100 nukleotidů je nutné generovat řetězce dlouhé 99, 98, 97, 96, 95. Třeba tak, že se DNA vhodným enzymem „nahlodá“ od jednoho konce.

Sanger využívá polymerázy, která řetězce neokusuje, ale naopak podle vzoru studované DNA molekuly tvoří. V reakční zkumavce jsou k dispozici stavební bloky - mononukleotidy (A,G,T,C), které polymeráza spojuje dohromady přesně po vzoru původní DNA. Problém je, že tímto způsobem by vzniklo jen mnoho stejně dlouhých kopii originální DNA. Sangerovo vylepšení PCR procedury spočívá v tom, že přimíchal do reakční směsi malé množství modifikovaných dideoxynukleotidů. Tyto nukleotidy jsou ochromeny tím, že jim chybí vazebná skupina. Po jejich zabudování do řetězce nemá polymeráza kam připojit následující nukleotid. I když je v reakční směsi pouze malé procento nukleotidů nahrazeno dideoxynukleotidy, je pravděpodobné, že řetězec DNA bude v určité fázi syntézy předčasně ukončen.

Takto generované různě dlouhé fragmenty je poté třeba analyzovat. K tomu se používá nejčastěji elektroforéza. Fragmenty DNA nesoucí náboj (obsahují přece kyselinu fosforečnou) migrují směrem k příslušné elektrodě gelovou matricí, která funguje jako molekulové síto. Krátké fragmenty se prodírají gelem rychleji než ty dlouhé, čímž dochází k separaci. Jak obtížná separace to je si lze ukázat na následujícím na příkladu. Představte si směs řetízků přibližně pět set oček dlouhých. Některé jsou trochu kratší, jiné trochu delší. Všechny jsou promíchané a je nemožné okem rozlišit pět set oček od řetízku o čtyřista devadesáti devíti očkách. Představte si však, že máte trubku, která je protkaná směsí tyčinek tak, aby uvnitř tvořily něco jako síto. Když nahoře vsypete řetízky do trubky a budete s ní dlouho chřestit, začnou nakonec dole vypadávat ven. Pokud dokážete zkonstruovat síto uvnitř trubky tak, aby řetízky vypadávaly přesně v pořadí velikosti, gratuluji. Dokázali jste to, co zvládne elektroforéza s molekulami DNA naprosto rutinně.

Když je DNA separována, zbývá už jen číst sekvenci. Sanger použil další trik - flurorescenčního značení. Představte si, že polymeráza zakončila vaše řetízky jedním ze čtyř barevně odlišených oček - dideoxynukleotidem A, T, C nebo G. Stačí kontrolovat, jakou barvu má právě vypadávající koncový dideoxynukleotid a zapisovat si pořadí. Přesně tak se to dělá i ve skutečnosti. Fluorescenční detektor zaznamenává fluorescenci, jejíž barva je určena jediným terminálním dideoxynukleotidem. A to nejdůležitější - terminální dideoxynukleotid je zabudován do fragmentu na základě komplementarity k původní sekvenované DNA. Příklad: Při separaci vypadne z kolony první fragment označený žlutým očkem (určuje A), pak detekujeme fragment zakončený očkem zeleným (T), žlutým (A), modrým (C), zeleným (T) a červeným (G). Prvních šest bází studované molekuly je tedy ATA CTG... Tak lze ze znalosti pořadí (délky) DNA fragmentů a barvy jejich fluorescence bezchybně vyvodit celou původní sekvenci.

Sangerovo sekvenování má několik výhod. DNA molekula je amplifikována, fluorescenční detekce je velmi citlivá a vyspělé separační metody umožňují číst sekvenci v délce tisíc i více nukleotidů v jedné analýze. Proto Projekt lidského genomu z velké části využívá právě tuto metodu.

Vědci se učili slabikovat písmena genetické abecedy jako prvňáčkové ve škole. Bohužel, znalost písmen neznamená, že automaticky porozuměli DNA jazyku. GAT CTT TAG. Mnoho smyslu to nedává. Není vůbec jasné, které části kódu jsou důležité geny. Tím méně bylo známo o funkci proteinu, který kódují. Co se stane, když je jeden, nebo určitá kombinace genů poškozená? Vědce čeká ještě hodně práce a na výzkum padne mnoho peněz daňových poplatníků. Proto je na místě otázka: Co nám genetika přinese? Vyplatí se vkládat miliardy do Projektu lidského genomu? Získáme za pár let, kdy bude rozluštěn kód celé lidské DNA, bájný elixír života? Abychom dokázali odpovědět, musíme se vrátit na začátek a zeptat se, co od genetiky očekáváme.

Slovo věda je odvozené od věděti. Na začátku dvacátého století genetika dosud vědou nebyla, protože jsme o genech nevěděli téměř nic. Dnes se informace o DNA sekvencích hromadí neuvěřitelným tempem. Zvětšuje se však naše porozumění fungování lidského organismu? Zdánlivě je to jednoduché. DNA slouží jako genetická databáze. Části její sekvence se přepisují do ribonukleové kyseliny (RNA) a ta je posléze použita jako návod k syntéze proteinů. Bohužel, vybudování obrovské databáze se sekvencí celé lidské DNA ještě není důvod k oslavám. Aby bylo jasné proč, je třeba si uvědomit, že všichni lidé nemají identickou DNA. Proto si nejsme všichni podobní jako vejce vejci!

Při porovnání dvou nepříbuzných lidí lze nalézt odlišnosti v DNA s frekvencí řádově jednou za tisíc bází. Stačí malá chyba v kódu, aby dotyčný protein s alterovanou aminokyselinou fungoval docela jinak než má. To je právě to, co vědce nejvíce zajímá. Nepatrné odlišnosti v sekvenci mohou být náhodně generovány při každém buněčném dělení. V první fázi replikace chromosomů občas polymerázy při kopírování DNA udělají chybu. Tyto mutace se vyskytují častěji, jestliže jsme vystaveni chemikáliím, či jiným mutagenům. Pokud se chyba přihodí při tvorbě vajíčka či spermie, přenáší se do další generace spolu s původní genetickou informací. Některé změny nejsou nebezpečné, protože se nenacházejí v oblasti DNA kódující proteiny. Jiné změny alterují skladbu proteinů, aniž to má viditelný vliv na jejich činnost. Je to jako když písařka zamění jedno písmeno ve dlouhé větě. Věta stále dává smysl, dokonce i postižené slovo je rozluštitelné. Existují však případy, kdy i nepatrná změna zkreslí význam slova a tím obrátí naruby smysl i celé věty. To je případ nebezpečné mutace.

Aby to bylo složitější, většina alterací DNA není považována za mutaci. Jestliže se stejná změna vyskytuje v populaci systematicky ve větší frekvenci než jedno procento, nazývá se to DNA polymorfismus. Dobrým příkladem jsou krevní skupiny. Schopnost červených krvinek přenášet kyslík není omezena, přestože po rodičích dědíme alterované geny (allely) definující proteiny na povrchu krvinek a tudíž určující naši krevní skupinu. Polymorfismy jsou vlastní příbuzenským skupinám lidí, národům i rasám. Proto Číňani vypadají jako Číňani a Dánové mají světlejší vlasy než Siciliáni.

Zdá se, že prvním hmatatelným výsledkem sekvenování DNA je možnost porovnat individuální DNA vzhledem k průměrné populaci, nebo lépe řečeno, zařadit ji do příslušných genotypů. Americká armáda již využívá genotypování k takzvanému genetickému otisku prstu, nezvratné identifikaci vojáků (a to i na základě ostatků). Stejný princip se uplatňuje v kriminalistice při identifikaci pachatele či oběti. Stačí kapka krve, nebo třeba vlas a zapírat je zbytečné.

Nejrozsáhlejším uplatněním bude stanovení genetické diagnózy. Ze znalosti genotypu a sady polymorfismů bude lékař moci vyvodit zdravotní rizika a náchylnost pacienta k různým chorobám. Americká firma Affymetrix vyvíjí přístroj, který bude testovat 100 000 různých DNA polymorfismů v analýze jediného vzorku. Vada na kráse genotypování spočívá v tom, že umožňuje předpovědět choroby, ale nedokáže je léčit. Z etického hlediska je těžko představitelná situace, kdy lékař oznámí pacientovi, že má devadesáti procentní šanci dostat nemoc, na níž dosud neexistuje lék. Pokud se tuto diagnózu dozví pacientova pojišťovna a zaměstnavatel, nezůstane to asi bez odezvy. Přes tyto etické pochybnosti se genotypování stává hlavním motorem výzkumu a vývoje nových léčiv. Jenom když porozumíme genetické podstatě nemocí, dokážeme je opravdu léčit.

Se zajímavou myšlenkou přišla nedávno americká firma Variagenics. Její vědci se zabývají farmakogenomikou neboli metodou, jak navrhnout léčivo šité pacientovi na tělo. Je známo, že i nejlépe tolerovaný lék může mít u některých pacientů vedlejší účinky, způsobit vážné zdravotní komplikace nebo i smrt. Tento jev souvisí s genotypem pacientů. Při pečlivém genotypování pacientů je možné předem vyloučit osoby, které příslušný lék nesnášejí. Problém je možné uchopit i z druhé strany. Některá farmaka neprošla při klinických testech, protože měla pozitivní účinky jen na malé procento pacientů. Takových léků, které se přes značné náklady na vývoj nedostaly do výroby, je velmi mnoho. Při pozitivní korelaci genotypu pacienta a terapeutického efektu bude možné uvést na trh novou řadu farmak, jež budou vhodná jen pro určitou skupinu nemocných, zato však účinnější než generické léky.

Sekvenování se nezaměřuje pouze na lidskou DNA. Mnoho prospěšného získáme i studiem zvířat či bakterií. Ještě zajímavější jsou studie virů, a to ze dvou důvodů. Virové choroby jsou tradičně těžkým oříškem i pro moderní medicínu. Lze sice připravit antivirovou vakcínu, ale protože viry rychle mutují, vakcíny mají časově omezenou účinnost. Při znalosti sekvence virů je možné s nimi snadněji bojovat. Je například možné vpravit do napadeného organismu kousky DNA komplementární k virové sekvenci. Tyto takzvané „antisens“ sekvence blokují virovou mRNA, a tak virům zabraňují v množení. Druhým důvodem, proč jsou viry středem zájmu je fakt, že dokážou účinně infikovat lidskou DNA. Tato vlastnost z nich dělá potenciálního kandidáta pro přenos geneticky modifikovaných sekvencí do živého organisnu. Předpovídá se, že modifikované viry budou sloužit pro opravu poškozených lidských genů.

Sekvenování a genotypování se uplatňuje nejen v medicíně a kriminalistice, ale i v historii a antropologii. Peter Gill z anglického Toxikologického institutu v roce 1996 potvrdil sekvenováním mitochondriální DNA, že pozůstatky těl nalezené v neoznačeném hrobu v Jekatěrinburgu nepochybně patří poslednímu ruskému carovi Mikuláši druhému, jeho ženě a dcerám. Určil při tom, která těla patří carským služebníkům a potvrdil, že v hrobě chyběly ostatky nejstarší dcery princezny Anastázie. K porovnání sekvencí použil DNA žijících potomků Romanovců z řad evropské aristokracie, kteří k tomuto účelu darovali svou krev.

Jiné fascinující výsledky byly publikovány v roce 1998 v časopise Science. Tým vědců vedených Svantem Pääbo izoloval mitochondriální DNA z fosílií Neandrtálců starých 40 000 let. Mitochondriální DNA je v těchto případech používána místo jaderné DNA proto, že se vyskytuje v buňkách ve stovkách kopiích, zatímco jaderná DNA jen v jediné. Přesto bylo extrémně obtížné extrahovat vzorek a zbavit se moderní DNA, která ve velkém množství kontaminovala pravěké vzorky, kdykoliv je neopatrní acheologové uchopili holou rukou. Výsledky překvapivě ukazují, že Homo Neandertalensis se od moderního člověka geneticky lišil mnohem více, než se předpokládalo. Na základě tohoto experimentu se zdá pravděpodobné, že Neandrtálská větev lidského rodu beze zbytku vyhynula, aniž se geneticky smísila s našimi prapředky.

Díky genotypování a sekvenování lze zpětně sledovat pohyby národů. Nelze vyloučit, že se v příštích letech dozvíme hodně zajímavého. České keltomaniaky určitě potěší, že český národ má v sobě více keltské krve, než se usuzovalo z archeologických nálezů. Naopak Prusové mají blíže k Slovanům, než by si Hitler byl přál.

Je jisté, že nás čeká ještě mnoho dalších překvapení. Nová technologie přináší stále nové a nové aplikace. Odpověď na výše položenou otázku o smyslu výzkumu se proto zdá být jasná. Vložené peníze přinesou zkrocení mnoha nemocí, vyšší kvalitu lidského života, účinnější diagnostiku a obrovské zisky farmaceutickým firmám. Je zřejmé, že genetický výzkum je doménou vyspělých a bohatých států. Je třeba nesmírných investic, které přinesou nejdříve výsledky právě v těchto zemích. Nové léky, příprava genetický modifikovaných tkání pro transplantace, složitá diagnostika, to vše bude velmi drahé a zcela jistě ne dostupné pro každého. Zostří se letitý etický problém - lékaři budou umět předpovědět propuknutí choroby léta předem, ale ne všichni pacienti si budou moci dovolit špičkovou léčbu. Navíc se zdá, že kromě ekonomického rozdělení světa přibude ještě další - genetické. Lze si snadno představit, že zaměstnavatelé budou využívat genotypování jako možnost předpovědět pracovní potenciál nového zaměstnance. Nadějní atleti budoucích olympijských her budou geneticky vytypováni již v dětství. Je to téma pro sci-fi literaturu, nebo nám hrozí individuální genetický rasismus? Blíží se éra genetického šlechtění člověka, jak popisuje Frank Herbert ve svém románu Duna?

Bubnovat dnes na poplach je poněkud opožděné. Přestože genetika je mladá věda, lidstvo provádí šlechtění již celá tisíciletí. Jak jinak lze nazvat výběr partnera založený na fyzické přitažlivosti a životním úspěchu (co jiného je atraktivní vzhled a inteligence než projev genů)? A co příbuzenské sňatky středověké šlechty kvůli zachování krve a majetku? Hodně se také hovoří o transgenních domácích zvířatech a hospodářských rostlinách. Vložené geny činí plodiny odolnější nemocem a umožňují vyšší výtěžky. Už dnes dokážeme ovlivnit metabolismus krav tak, aby produkovaly v mléce lidské proteiny pro farmaceutický průmysl. Protesty ochránců zvířat přicházejí opět pozdě. Člověk geneticky manipuloval s přírodou již od pravěku. Jak jinak lze nazvat domestikaci zvířat a plodin? Je evidentní, že například nepřeberná plemena psů nevznikla sama od sebe a pokud ano, měla by se příroda omluvit pekingskému palácovému psíkovi.

Brzy budeme mít nástroje, jak učinit lidský život zdravější a delší a také nástroje, které nám mohou o nás samých říci více, než je nám příjemné. Přesto se zdá nemyslitelné zastavit vývoj nových technologií a administrativně omezit směr, kudy se věda vydá. DNA přece neobsahuje neměnnou absolutní pravdu. Nežijeme v zajetí predestinace a náš osud není určen jedinou molekulou. Jestli potřebujete vědecké zdůvodnění, zde je: DNA je přepisována do proteinů, které vykonávají její příkazy. Ukazuje se, že ne pouze geny, ale i jejich přenos (translace) do proteinů je klíčovým biochemickým procesem, který také ovlivňuje lidský vývoj a zdraví zásadním způsobem. Naše vlohy je možné buď pěstovat, nebo trestuhodně promarnit.